Articles sur le même thème :
Les systèmes cell-free sont certes connus pour la production de protéines, mais ils le sont beaucoup moins pour leur capacité à produire des complexes protéiques pouvant contenir jusqu’à 1500 protéines. En effet, la nature ouverte des systèmes cell-free est avantageuse pour la co-expression de protéines, notamment parce que les rapports des matrices d’ADN et la composition des mélanges réactionnels, peuvent être optimisés et adaptés spécifiquement. Cette caractéristique, propre à ces systèmes, autorise non seulement l’expression concomitante de protéines solubles ou de protéines transmembranaires mais également l’assemblage de complexes protéiques.
Les systèmes cell-free permettent de produire des complexes protéiques fonctionnels et même d’augmenter les rendements dans certain cas.
À titre d’exemple, Synthelis a produit un complexe de deux protéines membranaires NOX2 et p22phox appelé cytochrome b558, en utilisant sa technologie cell-free exclusive (protégée par un brevet de portée mondiale), basée sur une souche dérivée d’Escherichia coli (Brault et al., 2017). Lorsqu’ils sont stimulés, les composants cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox s’associent au cytochrome b558 pour former le complexe nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase actif dans les membranes des cellules biologiques.
Le dysfonctionnement du complexe NADPH oxydase, chez des personnes atteintes de la granulomatose sceptique chronique (GSC), entraîne des infections pulmonaires qui peuvent mettre en péril la vie de ces patients. Cette maladie étant en attente de traitement efficace, une approche de thérapie protéique de remplacement de l’enzyme NOX2 dysfonctionnelle, pourrait être un traitement local efficace contre ces infections.
Pour reconstituer un complexe NADPH oxydase fonctionnel, Synthelis a co-exprimé in vitro les protéines NOX2 et p22phox dans des protéoliposomes en utilisant sa technologie brevetée cell-free : plusieurs ratios de matrices d’ADN ont été testés, la concentration optimale en Mg2+, K+, hémine et fer a été déterminée, ainsi que la composition de la bicouche lipidique des liposomes et la durée des réactions de synthèse. Des protéoliposomes contenant un complexe NADPH oxydase fonctionnel ont ainsi pu être obtenus.
Ces protéoliposomes NOX2/p22phox contenant des noyaux hèmes reconstitués, ont ensuite été incubés sur des cultures de macrophages X0-CGD déficients en dérivés réactifs de l’oxygène (ROS). Cette incubation a permis de délivrer le complexe fonctionnel à la membrane plasmique des cellules ciblées, et ainsi restaurer l’activité NADPH oxydase de ces cellules issues de patients.
Par ailleurs, ce même système d’expression cell- free à base d’E. coli, spécifiquement optimisé pour ce complexe NOX2/p22phox, a permis d’augmenter les rendements de production de ces deux protéines du cytochrome b558 humain, respectivement de 100 et 20 fois par rapport aux systèmes cellulaires de P. pastoris et baculovirus, précédemment utilisés pour la production d’un cytochrome bovin (Ostuni et al., 2010).
En utilisant la même approche, des particules de nanolipoprotéines fonctionnelles (NLPs) ont été produites en utilisant la co-expression d’un fragment d’apolipoprotéine A-I (Δ49A1) et d’une protéine transmembranaire, la bactériorhodopsine (bR), dans un système cell-free contenant des lipides et des cofacteurs (Cappuccio et al., 2008). Les NLPs associées aux protéines membranaires ont été produites en une seule réaction, stabilisant ainsi la protéine membranaire dès sa formation. Les deux extrémités de la protéine membranaire ont été rendus accessibles grâce à la NLP pour permettre l’interaction avec d’autres molécules, ce qui n’est pas possible lorsque les protéines membranaires sont exprimées sous forme de protéoliposomes.
Un autre exemple concerne la cytochrome c oxydase (CcO) qui a été produite à l’aide d’un système d’expression cell-free également issu d’une souche E. coli (Katayama et al., 2010). La CcO est une protéine membranaire composée de trois sous-unités et contenant deux hèmes A et trois ions cuivre. Les trois sous-unités ont été co-exprimées en présence d’hème A, de sulfate de cuivre et de fractions membranaires d’E. coli avec des structures en U spécifiques. À la fin, l’enzyme synthétisée a été comparée à l’enzyme d’origine et a montré une activité enzymatique et une structure comparables.
En outre, les systèmes cell-free permettent également l’assemblage de systèmes biochimiques beaucoup plus complexes. La synthèse complète de bactériophages a ainsi été réalisée à partir de génomes viraux entiers introduits dans un mélange réactionnel. Les bactériophages MS2, ΦX174 et T7 ont pu, par exemple, être synthétisés grâce à ces systèmes (Rustad et al., 2017). Plus récemment, le coliphage T4, l’un des plus grands virus utilisés comme modèle dans les études biologiques, a été synthétisé en ajoutant simplement son génome à un mélange réactionnel optimisé cell-free (Rustad et al., 2018). Ce résultat est remarquable en raison de la complexité du génome T4 qui comprend environ 289 gènes, dont 62 sont essentiels pour former des phages T4 viables et environ 50 codent pour les 1500 protéines qui forment les particules du phage T4 !
En conclusion, les systèmes d’expression cell-free permettent l’expression et l’assemblage de complexes protéiques fonctionnels, tels que le cytochrome b558 produit par Synthelis, ainsi que des entités biologiques beaucoup plus grandes, comme les bactériophages. Le principal avantage de la technologie cell-free pour exprimer de tels complexes protéiques, réside dans la possibilité d’ajuster le ratio de chaque composant du complexe pour obtenir in fine l’assemblage et la fonctionnalité de l’ensemble.
Ces progrès récents ouvrent la voie à de nouvelles applications utilisant le système d’expression cell-free, comme, par exemple, la thérapie protéique et la thérapie par les phages ou phagothérapie.
Authors & sources
Brault J., Vaganay G., Le Roy A., Lenormand J.-L., Cortes S., Stasia M.J. 2017. Therapeutic effects of proteoliposomes on X-linked chronic granulomatous disease: proof of concept using macrophages differentiated from patient-specific induced pluripotent stem cells. International Journal of Nanomedicine 12:2161–2177.
Cappuccio J.A., Blanchette C.D., Sulchek T.A., Arroyo E.S., Kralj J.M., Hinz A.K., Kuhn E.A., Chromy B.A., Segelke B.W., Rothschild K.J., Fletcher J.E., Katzen F., Peterson T.C., Kudlicki W.A., Bench G., Hoeprich P.D., Coleman M.A. 2008. Cell-free Co- expression of Functional Membrane Proteins and Apolipoprotein, Forming Soluble Nanolipoprotein Particles. Molecular & Cellular Proteomics 7:2246 –2253.
Katayama Y., Shimokata K., Suematsu M., Ogura T., Tsukihara T., Yoshikawa S., Shimada H. 2010. Cell-free synthesis of cytochrome c oxidase, a multicomponent membrane protein. Bioenerg Biomembr 42:235–240.
Ostuni M.A., Lamanuzzi L.B., Bizouarn T., Dagher M.C., Baciou L. 2010. Expression of functional mammal flavocytochrome (558) in yeast: comparison with improved insect cell system. Biochim Biophys Acta 1798(6):1179–1188.
Rustad M., Eastlund A., Marshall R., Jardine P., Noireaux V. 2017. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. Journal of Visualized Experiments 126:e56144.
Rustad M., Eastlund A., Jardine P., Noireaux V. 2018. Cell-free TXTL synthesis of infectious bacteriophage T4 in a single test tube reaction. Synthetic Biology 3(1):ysy002.