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Beaucoup de personnes gardent encore en tête que les systèmes cell-free offrent de faibles rendements d’expression de protéines. Si cette idée était vraie dans les années 2000, ce n’est certainement plus le cas aujourd’hui (Carlson et al., 2012).
Ainsi, nous pouvons à présent montrer que la technologie cell-free est aussi performante que les autres, et donne même de meilleurs résultats, pour certaines familles de protéines, comme nous l’expliquons ci-dessous.
De meilleurs résultats de rendement d’expression que les systèmes E. coli pour les protéines difficiles à exprimer.
En effet, les rendements obtenus avec les systèmes de production de protéines in vitro sont dans certains cas plus élevés qu’avec les systèmes basés sur E. coli, notamment pour les protéines difficiles à exprimer, comme les protéines membranaires, cytotoxiques ou encore les protéines instables.
A titre d’exemple, on peut citer les niveaux d’expression obtenus par des systèmes cell-free, complétés par des vésicules dérivées de membranes internes d’E. coli, pour produire deux protéines transporteurs membranaires intégrales: la perméase du mannitol à six domaines transmembranaires (MtlA) et la pompe à tétracycline à douze domaines transmembranaires (TetA), et ce, sans utiliser de détergents ni d’étape de repliement des protéines.
Ces deux transporteurs, MtlA et TetA, d’E. coli ont pu être produits avec des rendements respectifs de 130 ± 30 μg/mL et 570 ± 50 μg/mL (Wuuu et al., 2008) ; soit des rendements 60 à 400 fois plus élevés que ceux habituellement obtenus dans les systèmes cellulaires !
Il est maintenant fréquent d’avoir des rendements d’expression en systèmes cell-free élevés (supérieurs à 0,5 g/L), et les meilleures résultats peuvent atteindre 2g/L et même jusqu’à 100 g/L pour la valeur connue la plus haute !
Ces rendements d’expression élevés ont été obtenus grâce à des systèmes d’expression cell- free utilisant un métabolisme optimisé, doté d’un système de régénération de l’énergie amélioré et d’un recyclage des sous-produits. A titre d’exemple, jusqu’à 1,7 g/L de chloramphénicol acétyltransférase et 2,3 g/L de la protéine reporter deGFP, ont été obtenus à partir de maltodextrine ou de maltose pour recycler le phosphate inorganique et régénérer l’ATP (Kim et al, 2011 ; Cashera et al, 2013).
D’importants progrès ont également été réalisés pour obtenir des rendements d’expression élevés de protéines complexes contenant des ponts disulfures multiples (Carlson et al., 2012). Bien que des rendements inférieurs à 0,1 g/L aient été obtenus avant 2010, les protéines eucaryotes sécrétées telles que la rhGM-CSF sont désormais produites dans E. coli à 0,7 g/L (Zawada et al., 2011).
En conclusion, les progrès obtenus à la fois dans la préparation de l’extrait cellulaire, des systèmes de production d’énergie ainsi que dans la formation de ponts disulfures, permettent d’obtenir des rendements élevés en système d’expression cell-free.
Nous pouvons ainsi dire que les systèmes cell-free sont aussi performants que les systèmes d’expression conventionnels et devraient être testés de manière plus systématique. Il en est de même pour les niveaux d’expression atteints aujourd’hui avec la technologie d’expression cell-free, qui s’adaptent parfaitement à une production à l’échelle industrielle.
Rendement protéines membranaires in vitro vs. in vivo
Thromboplastine
- Système Cell-Free : 700 μg/mL
- Système cellulaire : 7 μg/mL
Récepteur à la bradykinin2
- Système Cell-Free : 85 μg/mL
- Système cellulaire : 0,1 μg/mL
Bak
- Système Cell-Free : 1000 μg/mL
- Système cellulaire : 10 μg/mL
Source: Protéines « Thromboplastine » et « Récepteur à la bradykinin 2 ». Système acellulaire Synthelis Vs. système cellulaire. Source: Protéine « Bak » Svetlana Nedelkina, Isa Gokce, Helen Ridley, Céline Weckerle, Thierry Magnin, François Vallette, Franc Pattus, Jeremy H. Lakey, Burkhard Bechinger , High-yield expression and purification of soluble forms of the anti-apoptotic Bcl-xL and Bcl-2 as TolAIII-fusion proteins, Elsevier, Protein Expression and Purification 60 (2008) 214–220.
Authors & sources
Carlson E.D., Gan R., Hodgman C.E., Jewett M.C. 2012. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances 30:1185–1194.
Caschera F., Noireaux V. 2013. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie 1-7.
Kim H.C., Kim T.W., Kim D.M. 2011. Prolonged production of proteins in a cell-free protein synthesis system using polymeric carbohydrates as an energy source. Process Biochem 46:1366–1369.
Li J., Lawton T.J., Kostecki J.S., Nisthal A., Fang J., Mayo S.L., Rosenzweig A.C., Jewett M.C. 2016. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal 11.
Wuu J.J., Swartz J.R. 2008. High yield cell-free production of integral membrane proteins without refolding or detergents. Biochimica y Biophysica Acta 1778 1237– 1250
Zawada J.F, Yin G., Steiner A.R., Yang J., Naresh A., Roy S.M., Gold D.S., Heinsohn H.G., Murray C.J. 2011. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production – A new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology Bioeng 108(7):1570-1578.