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Les protéines membranaires (PM) sont très importantes dans les cellules car elles remplissent une grande diversité de rôles, ce qui justifie l’intérêt croissant pour leur étude.
Cependant, les études fonctionnelles des protéines membranaires dans un environnement cellulaire natif sont difficiles à réaliser en raison de la complexité innée de la membrane cellulaire.
Pour surmonter ces difficultés, les MP peuvent être purifiées de leur environnement natif et réinsérées dans des systèmes mimétiques de la membrane, tels que les liposomes, ce qui permet leur étude fonctionnelle. Les protéoliposomes qui en résultent sont, à l’heure actuelle, des systèmes expérimentaux essentiels à la compréhension du mécanisme des MP.
Les protéoliposomes ont été utilisés pour étudier le transport membranaire, les événements de fusion membranaire (tels que les interactions entre virus et cellules hôtes), évaluer la détermination de la structure des MP par RMN dans leur pliage correct, et ont également été utilisés comme systèmes prometteurs d’administration de médicaments hydrophiles et hydrophobes [1].
À l’heure actuelle, les mesures fonctionnelles deviennent l’étape limitant le rythme dans l’étude des MP à l’aide de liposomes et plusieurs défis se présentent, à savoir la difficulté d’une reconstitution réussie, d’une coreconstitution et d’une orientation contrôlée des MP dans les liposomes, et le développement de méthodes améliorées pour la caractérisation précise des MP dans les protéoliposomes et pour le suivi des réactions, à savoir le développement de colorants fluorescents à haute sensibilité et à haute résolution temporelle [1].
Stratégies pour une reconstitution efficace des protéines membranaires dans les liposomes
La reconstitution efficace des particules dans les liposomes (qui affecte directement leur activité) est fortement influencée par la composition lipidique des liposomes. Contrairement aux membranes natives, les protéoliposomes contiennent beaucoup moins de protéines, car des quantités plus importantes de protéines entravent souvent le processus de reconstitution.
Plusieurs stratégies ont été développées pour surmonter cette limitation, comme la méthode GRecon qui utilise un gradient de densité de saccharose avec des concentrations croissantes de cyclodextrine et de liposomes déstabilisés par des détergents. Au cours du processus de reconstitution, le détergent est progressivement remplacé par des lipides, ce qui donne des protéoliposomes à forte teneur en protéines [2].
Les MP ont également été intégrés dans de petits disques de bicouches lipidiques entourés d’une protéine d’échafaudage imitant les propriétés des nanodisques. L’avantage de ces systèmes est que leur taille peut être modulée en faisant varier le rapport peptide/lipide, mais ils nécessitent l’utilisation préalable de détergents pour extraire la protéine de la membrane native [3]. Pour éviter l’utilisation de détergents, les particules lipidiques d’acide styrène-maléique (SMALP) peuvent être utilisées avec succès pour purifier et reconstituer fonctionnellement les MP dans des bicouches lipidiques [4].
Contrôle de l’orientation des protéines membranaires dans les protéoliposomes
On sait que l’orientation relative des MP insérées affecte de manière significative les études fonctionnelles réalisées avec les protéoliposomes. Cependant, le contrôle de l’orientation des MP dans les liposomes est difficile à réaliser car, au cours d’un processus de reconstitution, les MP sont insérées dans une orientation aléatoire, ce qui entraîne la production de différentes populations de protéoliposomes et provoque une hétérogénéité dans le système expérimental [1].
L’orientation semble plus uniforme lorsque les MP sont reconstituées dans des liposomes préformés et partiellement solubilisés par un détergent [5]. D’autres approches utilisées pour l’orientation guidée comprennent l’utilisation de billes fonctionnalisées au Ni-NTA pour immobiliser les MP marquées par His avant la reconstitution [6], et l’attachement d’un domaine de fusion à chaque extrémité de la protéine, ce qui permet de choisir l’une des deux orientations possibles [7].
Bien que cette méthode semble fonctionner pour les petites protéines sans domaine soluble, elle doit encore être testée avec des MP de grande taille. En outre, il est nécessaire de disposer de méthodes robustes et faciles à mettre en œuvre pour déterminer l’orientation relative des protéines, ce qui permettra d’évaluer de nouvelles méthodes de reconstitution [1].
Co-reconstitution de protéines membranaires multiples dans les liposomes
La co-reconstitution des MP, c’est-à-dire l’incorporation de différentes MP dans le même liposome, est souhaitable car elle permet d’étudier l’interaction de différentes protéines au niveau moléculaire et d’effectuer des mesures fonctionnelles en comparant la cinétique et l’efficacité entre des complexes individuels ou multiples [1].
Étant donné les exigences individuelles de chaque MP pour une reconstitution et une orientation optimales, il est difficile d’y parvenir, et il est proposé de procéder en deux étapes, à savoir la reconstitution individuelle de chaque protéine dans des conditions optimales, suivie de la fusion des deux populations.
Cette méthode n’a pas encore été testée avec des liposomes contenant des MPs [1]. Par ailleurs, une méthode garantissant une stœchiométrie de reconstitution 1:1 des MP a été mise au point, basée sur la chimie des maléimides et l’utilisation de liens ADN de longueurs appropriées [8].
Conception de sondes fluorescentes et utilisation de vésicules unilamellaires géantes dans la recherche sur les protéoliposomes
Un autre défi de la recherche sur les protéoliposomes concerne la conception rationnelle de colorants fluorescents pour suivre la fonction des protéines. À cet égard, l’utilisation de sondes fluorescentes ancrées dans la membrane présente des avantages par rapport aux colorants solubles, car les premières sont incorporées de manière efficace et stable dans les liposomes et ne s’échappent pas de la membrane.
Leur principal inconvénient est qu’elles sont distribuées de manière aléatoire dans les deux feuillets de la bicouche. Pour surmonter ce problème, un double brin d’ADN peut être utilisé entre l’ancre lipophile et la partie fluorescente [9]. Des sondes ancrées dans la membrane plus perfectionnées reposent sur des modifications structurelles de motifs d’ADN sensibles à l’environnement [10]. Bien que ces stratégies aient été principalement utilisées in vivo, ces sondes complexes pourraient être utiles pour les études sur les liposomes.
Les expériences sur une seule molécule avec des MP incorporées dans des liposomes pourraient également permettre de surveiller les mécanismes de changement de liaison et de changement de pH dans le lumen des petites vésicules unilamellaires (SUV) [11].
Les orientations futures de la recherche sur les protéoliposomes comprennent l’utilisation de vésicules unilamellaires géantes (GUV) pour étudier la fonction des MP (1). Les vésicules unilamellaires géantes sont beaucoup plus grandes que les liposomes classiques et peuvent donc être observées directement par des techniques de microscopie optique. En outre, leur surface et leur volume intérieur accrus permettent d’incorporer des machineries protéiques entières, de petites vésicules ou même des bactéries entières, imitant ainsi les fonctions complexes des cellules et présentant un potentiel pour la recherche sur les cellules artificielles. Cependant, ils sont moins robustes que les liposomes classiques et leur préparation est moins simple. En outre, l’insertion des MP dans la membrane des GUV n’est pas aussi facile, ce qui a entravé, jusqu’à présent, leur utilisation dans les expériences de transport vectoriel avec les MP [12].
Par ailleurs, des vésicules de la taille d’une cellule formées à partir de polymères synthétiques, appelés polymersomes, ont été utilisées avec succès pour imiter la compartimentation de la cellule eucaryote ou pour permettre la séparation spatiale des réactions de synthèse multi-enzymes [13].
En outre, des méthodes de détection avec une résolution temporelle et une sensibilité élevées sont nécessaires, ainsi que des fluorophores photostables pour réduire le blanchiment pendant l’observation. Certaines des approches actuelles, telles que les mesures de molécules uniques et la microfluidique, nécessitent une expertise technique et des équipements spécialisés. Enfin, comme les expériences de microscopie produisent une grande quantité de données, un logiciel d’analyse convivial mais puissant est également nécessaire [1].
Rédigé par Luísa Silva, PhD et rédactrice scientifique
Synthelis
En tant que prestataire de services ayant plus de 13 ans d’expérience dans la technologie acellulaire et l’expression de protéines membranaires, Synthelis peut produire des protéines membranaires fonctionnelles et orientées sous forme de protéoliposomes en utilisant soit son approche brevetée pour incorporer directement la cible protéique dans la bicouche lipidique des liposomes, soit après solubilisation et purification des protéines suivies d’une phase de relipidation. Les deux approches ont leurs avantages et leurs inconvénients. Notre équipe possède également le savoir-faire et l’expérience nécessaires pour produire des protéines membranaires soit solubilisées dans un détergent, soit sous forme de nanodisques
Si vous avez un tel projet et souhaitez discuter de sa faisabilité, n’hésitez pas à nous contacter.
Sources
[1] Amati A.M., Graf S., Deutschmann S., Dolder N., von Ballmoos C. 2020. Current problems and future avenues in proteoliposome research. Biochem. Soc. Trans. 48:1473-1492.
https://doi.org/10.1042/BST20190966
[2] Althoff T., Davies K.M., Schulze S., Joos F., Kühlbrandt W. 2012. GRecon: A method for the lipid reconstitution of membrane proteins. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51:8343-8347.
https://doi.org/10.1002/anie.201202094
[3] Schuler M.A., Denisov I.G., Sligar S.G. 2013. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol. Biol. 974:415-433. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-275-9_18
[4] Dörr J.M., Scheidelaar S., Koorengevel M.C., Dominguez J.J., Schäfer M., van Walree C.A., Killian J.A. 2016. The styrene–maleic acid copolymer: a versatile tool in membrane research. Eur. Biophys. J. 45:3-21. https://doi.org/10.1007/s00249-015-1093-y
[5] Pagano A. Spiess M. 2005. Reconstitution of Rab4-dependent vesicle formation in vitro. Methods Enzymol. 403:81-92. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(05)03008-9
[6] Zheng H., Lee S., Llaguno M.C., Jiang Q.-X. 2016. bSUM: A bead-supported unilamellar membrane system facilitating unidirectional insertion of membrane proteins into giant vesicles. J. Gen. Physiol. 147:77-93. https://doi.org/10.1085/jgp.201511448
[7] Ritzmann N., Thoma J., Hirschi S., Kalbermatter D., Fotiadis D., Müller D.J. 2017. Fusion domains guide the oriented insertion of light-driven proton pumps into liposomes. Biophys. J. 113:1181-1186.
https://doi.org/10.1016/j.bpj.2017.06.022
[8] Raschle T., Lin C., Jungmann R., Shih W.M., Wagner G. 2015. Controlled co-reconstitution of multiple membrane proteins in lipid bilayer nanodiscs using DNA as a scaffold. ACS Chem. Biol. 10:2448-2454.
https://doi.org/10.1021/acschembio.5b00627
[9] Dolder N., von Ballmoos C. 2020. Bifunctional DNA duplexes permit efficient incorporation of pH probes into liposomes. ChemBioChem. 21:2219-2224. https://doi.org/10.1002/cbic.202000146
[10] Dembska A., Bielecka P., Juskowiak B. 2017. pH-Sensing fluorescence oligonucleotide probes based on an i-motif scaffold: a review. Anal. Methods 9:6092-6106. https://doi.org/10.1039/c7ay01942d
[11] Veshaguri S., Christensen S.M., Kemmer G.C., Ghale G., Møller M.P., Lohr C., Christensen A.L., Justesen B.H., Jørgensen I.L., Schiller J., Hatzakis N.S., Grabe M., Pomorski T.G., Stamou D. 2016. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science 351:1469-1473.
https://doi.org/10.1126/science.aad6429
[12] Jørgensen I.L., Kemmer G.C., Pomorski T.G. 2017. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. Eur. Biophys. J. 46:103-119.
https://doi.org/10.1007/s00249-016-1155-9
[13] Klermund L., Poschenrieder S.T., Castiglione K. 2017. Biocatalysis in polymersomes: improving multienzyme cascades with incompatible reaction steps by compartmentalization. ACS Catal. 7:3900-3904. https://doi.org/10.1021/acscatal.7b00776