Les systèmes cell-free ne conviennent pas pour la production de protéines à échelle industrielle

Les rendements ont augmenté et les coûts ont baissé !

En effet, une à une, les limites des débuts de la technologie cell-free ont été corrigées : et comme le décrit Zawada dans ses travaux, elle est maintenant constante, robuste, et rentable (Zawada et al. 2011) :
• les rendements ont augmenté,
• l’utilisation de réactifs coûteux n’est plus nécessaire,
• les réactions ont été prolongées et,
• les échelles de réaction ont fortement augmenté (Carlson et al. 2012).

Les chercheurs et industriels peuvent ainsi avoir accès à une plateforme performante et rentable pour la production de protéines à échelle industrielle.

Ceci tient notamment à une meilleure connaissance des réactions métaboliques qui s’opèrent dans ces systèmes cell-free et à l’élimination d’étapes non essentielles ou non destinées à la production de protéines (Kim et al. 1999, 2000, 2001). Les systèmes d’expression cell-free ont ainsi été optimisés pour que l’énergie et les réactions soient entièrement consacrées à la production de protéines et non dissipées vers d’autres voies.

Après une période de congélation d’un an, les extraits cellulaires sont toujours utilisables !

De plus, des avancées majeures ont aussi été réalisées dans le procédé de préparation de l’extrait cellulaire afin de réduire le temps et les coûts associés, et d’améliorer la capacité de cet extrait à synthétiser des protéines et obtenir une production à haut rendement.
Par exemple, la fermentation à haute densité avec E. coli a été développée, permettant la préparation de grands volumes d’extrait cellulaire (Zawada et al. 2005) :
• Les temps et les coûts des étapes d’activation, d’extraction et de clarification nécessaires à l’obtention de l’extrait, ont été fortement diminués et ensuite optimisés (Liu et al. 2005).
• La possibilité de travailler avec un extrait sur une longue période de temps a également été confirmée suite à une congélation pendant un an, sans perte d’activité de l’extrait (Zawada et al. 2011).
Les systèmes cell-free ne conviennent pas pour la production de protéines à échelle industrielle

Par ailleurs, des systèmes énergétiques, stables et peu coûteux, pour la régénération de l’ATP (adénosine triphosphate) ont été mis au point afin de réduire le coût des systèmes cell-free. Les systèmes cell-free conventionnels utilisent des enzymes, des cofacteurs ou des molécules donneuses de phosphate, coûteux pour la régénération de l’ATP, ce qui ne permet pas l’utilisation de ces systèmes à une échelle industrielle.
A l’inverse, les systèmes alternatifs, tels que ceux qui activent le métabolisme central par la phosphorylation oxydative du glutamate (Jewett et al. 2008) ou l’hexamétaphosphate couplé à la maltodextrine (Cashera et al. 2015) ont, par exemple, permis une réduction significative des coûts.

En conclusion, les temps de production raccourcis font du système cell-free une plateforme de production de protéines :
• Puissante et performante notamment pour l’expression de protéines à haut débit (Casteleijn et al. 2013),
• Pour accélérer le développement d’un produit ou,
• A des fins de médecine personnalisée (Kanter et al. 2007).

*Synthelis a renouvelé sa licence exclusive mondiale, issue d’un brevet basé sur un système cell-free, qui permet d’exprimer des protéines membranaires en présence de liposomes. Numéro de brevet Européen : 2 140 015, délivré le 4 avril 2018 par le “European Patent Office (EPO) » et validé pour l’Allemagne, la Belgique, la France, Le Royaume Uni, la Suisse et le Liechtenstein. Ainsi que pour les Etast-Unis, le Japon et l’Australie: UGA patent N°FR0754701, US9, 206456, JP5421241, AUST 2008263765.

Une réaction de synthèse à une échelle de 100 L est possible en système cell-free !

Un autre aspect souvent ignoré, est la capacité de la technologie cell-free a généré de hauts rendements d’expression même en grand volume. En effet, des volumes réactionnels allant de 15μL à 1mL sont souvent mentionnés, mais les paramètres du procédé ont été développés et optimisés dans des fermenteurs avec agitation, pour permettre une réaction de synthèse à une échelle de plus de 100 litres !

Pour ce faire, des équipements et des procédés compatibles avec une production de protéines à échelle industrielle ont été utilisés : la réaction a été réalisée dans des cuves standard ; le pH et la concentration en oxygène dissout ont été régulés, la mousse a été réduite et la croissance bactérienne, quant à elle, a été inhibée (Zawada et al. 2011).

Il résulte de ces avancées technologiques combinées à l’utilisation d’équipements « pilotes », la production en 10 heures de rhGM-CSF actif dans un système cell-free à des rendements de 700 mg/L pour une échelle de 100 litres. Plus concrètement, cela signifie que 70 kg de rhGM- CSF ont été produits en 10 heures tout en respectant la norme GMP requise par les agences réglementaires pour la production de protéines de qualité pharmaceutique (Zawada et al. 2011) !

En conclusion, ces différents résultats démontrent clairement que les systèmes cell-free ne sont plus cantonnés à la production de protéines à petite échelle, mais qu’ils conviennent depuis quelques années maintenant, aux applications industrielles de production à grande échelle.

Authors & sources

Carlson E.D., Gan R., Hodgman C.E., Jewett M.C. 2012. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances 30:1185–1194.

Cashera F., Noireaux V. 2015. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering 27:29-37.

Jewett M.C, Calhoun K.A., Voloshin A., Wuu J.J., Swartz J.R. 2008. An integrated cell- free metabolic platform for protein production and synthetic biology. Molecular Systems Biology 4(220).

Kim D.M., Swartz J.R. 1999. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng 66:180–8.

Kim D.M., Swartz J.R. 2000. Prolonging cell-free protein synthesis by selective reagent additions. Biotechnol Prog 16:385–90.

Kim D.M., Swartz J.R. 2001. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng 74:309–16.

 Liu D.V., Zawada J.F., Swartz J.R. 2005. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog 21(2):460– 465.

Zawada J., Swartz J. 2005. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnol Bioeng 89(4):407-415.