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La diversité et la praticité mises en avant pour les kits d’expression cell-free ont mené à leur utilisation accrue au cours de ces dernières années.
Cependant, malgré cette multitude de kits cell-free disponibles sur le marché, ils n’offrent pas autant de flexibilité et d’efficacité que les solutions sur mesure proposées par des prestataires de services maîtrisant ce type de systèmes. En effet, dans les kits, le mix réactionnel de base est prédéterminé et l’ajout de composants spécifiques à une protéine est limité. Il en résulte que de nombreux utilisateurs n’obtiennent pas les résultats escomptés; ceci peut les faire passer à côté d’une protéine d’intérêt et ils restent alors avec le sentiment que la technologie cell-free est inefficace, sans connaître l’étendue des possibles de ces systèmes quand ils sont « faits maison » et donc adaptables !
Les kits d’expression cell-free présentent des avantages mais restent limités par rapport aux systèmes cell-free faits « maison », personnalisables et optimisables.
Comment fonctionnent ces kits ? Tout d’abord, ils sont disponibles auprès de plusieurs fournisseurs, dont NEB, Arbor Biosciences, Biotechrabbit, CellFree Sciences, Promega, Qiagen et Thermo Fisher Scientific. En général, ils sont fournis avec des vecteurs d’expression qui contiennent un gène rapporteur, un promoteur et d’autres séquences servant à optimiser la synthèse protéique cell-free. Ils fonctionnent la plupart du temps sur un principe de transcription et traduction couplées. Ils permettent souvent l’utilisation de matrices d’ADN linéaire générées par PCR (Chong, 2014). Ces kits commerciaux utilisent principalement des extraits issus de souches bactériennes d’Escherichia coli, de cellules de réticulocytes de lapin, d’endospermes de germes de blé et, plus récemment, de cellules d’insectes, de CHO ou de cellules humaines HeLa.
En plus de ces kits à base d’extraits cellulaires, un système d’expression entièrement reconstitué à partir de protéines recombinantes a également été développé (appelé système PURE). Il est constitué de l’ensemble minimal des composants purifiés permettant la transcription et la traduction d’un gène en protéine. Ce système a l’avantage de s’affranchir, entre autres, de nucléases et de protéases qui diminuent la durée de vie de l’ADN, de l’ARNm et des protéines (Rosenblum et al., 2014). Le processus en aval est également simplifié en raison de la composition minimale du mélange réactionnel (Casteleijn et al., 2013). Cependant, le coût par mg de protéine synthétisée est beaucoup plus élevé qu’avec les kits cell-free à base de lysat et ne peut être utilisé que pour une production à petite échelle.
Malgré le développement de ces kits commerciaux, les systèmes cell-free « maison » offrent des avantages forts, grâce principalement à leur nature ouverte, en opposition avec les kits qui sont « fermés » et ne permettent donc pas d’ajuster la composition du mélange réactionnel aux spécificités de la protéine à synthétiser.
En effet, pour de nombreuses protéines, les mélanges réactionnels doivent être optimisés spécifiquement et ajustés avec des concentrations particulières de sels, avec des cofacteurs, des chaperonnes et/ou d’autres additifs permettant d’améliorer les rendements et assurer le bon repliement de la chaîne polypeptidique (Rosenblum et al., 2014). De tels processus d’optimisation nécessitent un savoir-faire spécifique pour être efficaces et rapidement mis au point.
De plus, le bon repliement des protéines, souvent lié aux ponts disulfures, peut être amélioré, par exemple, par un prétraitement de l’extrait cellulaire avec de l’iodo-acétamide, en optimisant le potentiel redox du mélange par l’ajout de glutathionne oxydée et réduite, et en ajoutant des chaperonnes et des isomérases.
Des agents stabilisants peuvent également être ajoutés au mélange réactionnel, tels que des polyéthylèneglycols, des polyols ou des acides aminés, pour réduire l’agrégation des protéines et éviter leur précipitation (Kai et al., 2013). A titre d’exemple, Synthelis a identifié, dans le cadre d’un projet pour Sanofi Pasteur, deux additifs qui ont permis la production d’un antigène vaccinal à 100 % sous forme soluble, alors qu’il était produit entièrement sous forme agrégée en corps d’inclusion avec le système E. coli in vivo.
Enfin, les systèmes cell-free « maison » qui permettent une grande adaptabilité, présentent de nombreux avantages pour l’expression de protéines transmembranaires car ces dernières nécessitent l’ajout de détergents ou de lipides spécifiques dans le mix réactionnel pour obtenir des protéines bien conformées et fonctionnelles. Ainsi leur utilisation a, par exemple, permis la production de canaux potassiques Kv1.3, composés de quatre sous-unités alpha disposées autour d’un pore central, sous forme de protéoliposomes en utilisant des lipides et des détergents (Renauld et al., 2017). L’activité des canaux ainsi produits a été vérifiée à l’aide d’une sonde moléculaire fluorescente, l’oxonol VI, démontrant un flux d’ions potassiques spécifiques (Cortes et al, 2018).
En conclusion, bien qu’il existe sur le marché de nombreux kits cell-free pouvant donner des résultats intéressants avec certaines protéines, ils n’offrent pas autant de flexibilité et d’adaptabilité que les préparations cell-free « maison » qui sont optimisables. Ces systèmes « maison » et le savoir-faire des prestataires qui les ont développés et les manipulent, offrent donc de plus grandes chances de succès, tout particulièrement pour les protéines difficiles qui nécessitent un ajustement spécifique des mix réactionnels pour obtenir de bon rendements d’expression, ainsi que la solubilisation et la fonctionnalité de ce type de protéines.
Authors & sources
Casteleijn M.G., Urtti A., Sarkhel S. 2013. Expression without boundaries: cell- free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics 440:39-47.
Chong S. 2014. Overview of Cell-Free Protein Synthesis: Historic Landmarks, Commercial Systems, and Expanding Applications Curr Protoc Mol Biol. 108: 16.30.1– 11.
Cortes S., Barette C., Beroud R., De Waard M., Schaack B. 2018. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification 145:94–99.
Kai, L., Dötsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. 2013. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS ONE 8(2): e56637.
Renauld S., Cortes S., Bersch B., Henry X., De Waard M., Schaack B. 2017. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. BBA – Biomembranes
1859:2373–2380.
Rosenblum G. and Cooperman, B.S. 2014. Engine out of the chassis: Cell-free protein
synthesis and its uses. FEBS Letters 588:261–268.
Yin G., Swartz J.R. 2004. Enhancing multiple disulfide bonded protein folding in a
cell-free system. Biotechnol Bioeng. 86(2):188-95