Les amyloïdes sont des agrégats de protéines présentant une structure fibrillaire non ramifiée typique, qui sont impliqués dans plusieurs maladies de mauvais repliement des protéines, associées à des maladies neurodégénératives telles que les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, et les maladies à prions [1].

Il existe également des amyloïdes fonctionnels, qui sont des agrégats de protéines partageant la même structure que les amyloïdes pathologiques, mais qui présentent des fonctions différentes qui présentent certains avantages, telles que la participation à des processus de signalisation ou à l’immunité innée [2]. L’étude de la relation structure-fonction des amyloïdes fonctionnels a été principalement réalisée par résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’état solide, en s’appuyant surtout sur la détection des noyaux 13C et 15N, mais aussi sur des techniques plus récentes, à savoir la rotation rapide à angle magique (MAS) et la détection du 1H. Afin d’améliorer leur sensibilité, ces méthodes nécessitent l’enrichissement de l’échantillon avec des isotopes actifs en RMN.

Synthèse acellulaire : un moyen plus sûr de produire des fibrilles amyloïdes 

En raison de la nature hydrophobe des protéines et des peptides amyloïdogènes et de leur forte propension à s’agréger, il est difficile de les synthétiser dans des systèmes cellulaires, car ils sont souvent déposés sous forme de corps d’inclusion. Par conséquent, leur production nécessite des étapes supplémentaires de dénaturation chimique avant la purification, et d’autres étapes de repliement pour isoler la protéine active. Elles peuvent également être cytotoxiques, ce qui entraîne de faibles rendements de production. En outre, la préparation des échantillons comprend une étape finale d’agrégation des protéines in vitro, qui peut entraîner un polymorphisme structurel et des lignes RMN étendues. En revanche, la synthèse acellulaire de ces agrégats de protéines surpasse les problèmes rencontrés par la production cellulaire. La procédure est plus sûre et il est facile d’incorporer des acides aminés naturels et non naturels qui peuvent être marqués isotopiquement.

Synthèse acellulaire : un moyen de produire des prions purs et fonctionnels 

La production cell-free de fibrilles amyloïdes pour l’analyse par RMN MAS a été récemment rapportée [3]. L’approche utilise la possibilité conférée par les systèmes cell-free d’incorporer des isotopes actifs en RMN à des positions spécifiques. Dans ce travail, le prion amyloïde fonctionnel HET-s (218-289), un domaine formant le prion du champignon filamenteux Podospora anserina, a été produit. La synthèse a été réalisée par une méthode de dialyse, à 30 °C pendant 18 h, avec un extrait d’E. coli S30 (figure 1a).

Synthelis - Technologie Cell-Free

Figure 1 – Synthèse acellulaire du domaine formant le prion de l’HET-s [3] : a – représentation schématique de la synthèse CF (FM – mélange d’alimentation, RM – mélange réactionnel) ; b – le RM est récolté par centrifugation et lavé pour obtenir l’échantillon RMN ; c – micrographie électronique des fibrilles amyloïdes HET-s synthétisées par CF (barre d’échelle = 100 nm) ; d – les fibrilles amyloïdes HET-s synthétisées par CF déclenchent la conversion phénotypique des souches [Het-s*] (infection) détectée comme une réaction de mort cellulaire régulée observée par la réaction de barrage (flèche jaune) lorsque la souche focale au centre de la plaque est confrontée aux quatre souches [Het-S] à la périphérie. Reproduit avec l’autorisation de l’auteur.

Cette procédure a permis d’isoler la protéine agrégée sous une forme pure. Les monomères de HET-s se sont spontanément auto-assemblés dans le mélange réactionnel et ont présenté une morphologie fibrillaire, comparable à celle obtenue par les procédures standard (figure 1c). En outre, les fibrilles amyloïdes HET-s synthétisées par CF ont effectivement induit la formation du prion [Het-s] in vivo chez P. anserina (figure 1d), présentant le même comportement infectieux que les fibrilles assemblées in vitro à partir du domaine de formation du prion HET-s purifié.

Synthèse acellulaire : un moyen rapide et efficace de produire des protéines

L’expression de la protéine grâce à la technologue cell-free était déjà visible après 6 heures, montrant un processus de traduction rapide de la protéine, et le rendement de la réaction était d’environ 1 mg/ml, ce qui est comparable à la synthèse cell-free de protéines membranaires intégrales à partir d’extraits d’E. coli S30. Cette quantité de culot était suffisante pour être utilisée dans des rotors RMN à l’état solide de petite taille.

Afin d’effectuer une analyse RMN MAS, des isotopes 13C et 15N adaptés et des étiquettes fluorées ont été incorporés dans le mélange réactionnel. Les résultats de la RMN ont montré que la conformation locale des résidus des agrégats de HET-s synthétisés par CF était comparable à la conformation de la forme infectieuse de référence des fibrilles amyloïdes de HET-s, et qu’un très faible polymorphisme structurel a été observé au niveau des résidus.

Synthèse acellulaire : un moyen rentable de produire des protéines

L’ensemble de ces résultats suggère que le processus de pliage et d’assemblage des monomères HET-s dans le mélange réactionnel CF a permis de former des agrégats fibrillaires ayant la même conformation que l’amyloïde infectieuse obtenue à partir de la procédure de recombinaison. La détection du 1H et l’analyse par RMN MAS 19F ont été effectuées sur les fibrilles amyloïdes produites par CF, ce qui prouve que le produit cell-free peut être caractérisé par les techniques mentionnées, à des niveaux inférieurs au milligramme. En outre, l’approche cell-free s’est révélée très rentable pour l’introduction d’acides aminés fluorés, par rapport à la surexpression bactérienne standard, étant donné que de plus petites quantités d’acides aminés fluorés ont été utilisées.

Rédigé par Luísa Silva, PhD et rédactrice scientifique.

 

Synthelis

La synthèse cellulaire des protéines est une méthode efficace et pratique pour le marquage isotopique des protéines. Elle offre de toutes nouvelles possibilités pour les méthodes de RMN. Si, comme beaucoup, vous êtes à la recherche d’un système d’expression plus économique, la synthèse acellulaire est la voie à suivre. Chez Synthelis, nous disposons de l’expertise nécessaire pour vous aider à produire efficacement des protéines marquées par isotopes pour vos expériences de RMN en utilisant le milieu cellulaire. Contactez-nous !

Sources

[1] Chiti F., Dobson C.M. 2017. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade. Annu. Rev. Biochem. 86:27-68. https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-061516-045115

[2] Cai X., Chen J., Xu H., Liu S., Jiang Q.-X., Halfmann R., Chen Z.J. 2014. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell 156:1207-1222. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.063

[3] Lends A., Daskalov A., Maleckis A., Delamare A., Berbon M., Grélard A., Morvan E., Shenoy J., Dutour A., Tolchard J., Noubhani A., Giraud M.-F., Sanchez C., Habenstein B., Guichard G., Compain G., Jaudzems K., Saupe S.J., Loquet A. 2022. Cell-free synthesis of amyloid fibrils with infectious properties and amenable to sub-milligram magic-angle spinning NMR analysis. Commun. Biol. 5:1202. https://doi.org/10.1038/s42003-022-04175-1

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