La luminescence est l’émission de rayonnement par une substance non incandescente et implique deux étapes : une excitation, durant laquelle un état excité est produit, suivie d’un retour à l’état fondamental accompagné d’une émission lumineuse. La luminescence est largement utilisée dans la recherche scientifique et, en particulier, la fluorescence et la bioluminescence sont abondamment employées dans le développement de tests basés sur la lumière, car elles permettent de détecter et quantifier des événements biologiques ainsi que de visualiser des processus moléculaires grâce à des rapporteurs et sondes fluorescents ou bioluminescents. Ainsi, les essais basés sur la fluorescence et la bioluminescence constituent des outils précieux pour le suivi de l’expression génique, de l’activité enzymatique, des métabolites, des médicaments ou encore des cellules dans des modèles in vitro et in vivo [1,2]. Cependant, la fluorescence et la bioluminescence reposent sur des mécanismes d’émission lumineuse différents et présentent donc des implications fonctionnelles distinctes, chacune possédant ses avantages et ses limites, qu’il convient de prendre en compte pour choisir la stratégie la plus adaptée à votre expérience.
Qu’est-ce que la fluorescence et la bioluminescence ?
La fluorescence et la bioluminescence sont toutes deux des formes de luminescence, mais elles se distinguent par leur mécanisme d’excitation. Dans la fluorescence, l’excitation d’une molécule (fluorophore) résulte d’une irradiation lumineuse (Figure 1), tandis qu’en bioluminescence, les molécules excitées sont produites par des réactions biochimiques spécifiques (Figure 2).
Figure 1 – Schéma de la fluorescence.
Figure 2 – Schéma de la bioluminescence.
Certains organismes vivants, comme les lucioles, produisent de la lumière grâce à des réactions chimiques catalysées par des enzymes. En général, ce processus implique l’oxydation d’un composé (Sred) en une espèce excitée (Sox*) qui revient ensuite à l’état fondamental (Sox) en produisant de la lumière comme sous-produit.
Dans ce schéma, A est un co-réactif ou cosubstrat et P est un produit de réaction. La réaction biochimique met en jeu une enzyme et un substrat (le composé oxydé). Par exemple, la luciférase extraite de la luciole Photinus pyralis utilise l’adénosine-5’-triphosphate (ATP) comme cosubstrat dans l’oxydation de la luciférine par l’oxygène (Figure 3).
Figure 3 – Représentation schématique de l’oxydation de la luciférine en oxyluciférine, catalysée par la luciférase. Reproduit à partir de [3].
Les luciférases et leurs substrats luciférines sont aussi variés structurellement que les organismes dont ils proviennent, chacun possédant sa propre longueur d’onde d’émission et son rendement quantique.
Principales différences entre fluorescence et bioluminescence
La fluorescence nécessite une source lumineuse externe pour irradier l’échantillon et induire la fluorescence des composés présents dans l’échantillon. Si l’analyte n’est pas fluorescent, il peut être marqué avec une étiquette fluorescente (un fluorophore), qui peut être un colorant organique, un complexe métallique ou une nanoparticule luminescente. Le fluorophore absorbe la lumière à une longueur d’onde et l’émet à une longueur d’onde plus longue, et des filtres sont utilisés pour séparer la lumière d’excitation de la lumière d’émission, permettant ainsi la détection du signal d’intérêt.
L’instrumentation est complexe et comprend la source lumineuse, des filtres pour sélectionner les faisceaux lumineux d’excitation et d’émission ainsi qu’un détecteur. Bien qu’elle offre une grande flexibilité pour le multiplexage (l’utilisation de plusieurs marqueurs fluorescents distincts pour détecter et quantifier simultanément différentes cibles), le coût élevé des équipements peut constituer une limitation. Un autre inconvénient important de la fluorescence est la possibilité d’apparition d’un bruit de fond, due à l’absorption de la lumière d’excitation par l’échantillon ou le milieu et à l’autofluorescence qui en résulte, ce qui peut interférer avec la détection, en particulier pour les cibles faiblement abondantes ou les échantillons hétérogènes. Par conséquent, la limite de détection est restreinte à des valeurs supérieures à celles attendues pour un signal sans bruit de fond.
À l’inverse, la bioluminescence émet de la lumière grâce à une réaction biochimique et ne nécessite pas de source lumineuse externe. L’instrumentation est donc plus simple que celle des équipements basés sur la fluorescence, car elle ne requiert pas les systèmes optiques complexes des instruments fluorescents. De plus, l’absence de faisceau d’excitation évite ou minimise la présence de bruit de fond diffusé pouvant interférer avec les essais et permet d’atteindre de très faibles limites de détection. En outre, la majorité des systèmes biologiques n’émettent pas naturellement de bioluminescence ; le rapport signal/bruit est donc généralement élevé, ce qui rend la bioluminescence particulièrement adaptée à la détection de signaux faibles. Cependant, les essais bioluminescents nécessitent un luminomètre très sensible capable de détecter des signaux lumineux de faible intensité afin de fournir des résultats précis.
Le Tableau 1 résume et compare les principales caractéristiques de la fluorescence et de la bioluminescence.
Sensibilité et rapport signal/bruit
La sensibilité désigne la capacité de la méthode à distinguer le signal analytique du signal de fond.
La fluorescence offre une grande sensibilité puisque des signaux analytiques intenses peuvent être générés, en fonction des caractéristiques intrinsèques des fluorophores (notamment l’absorptivité molaire et le rendement quantique de fluorescence) et de la concentration de la molécule fluorescente (l’intensité du signal de fluorescence est directement proportionnelle à la concentration de la molécule fluorescente à condition que l’absorbance, et donc la concentration, soit très faible). Le signal analytique est également proportionnel à la puissance du faisceau d’excitation et, par conséquent, la sensibilité peut être améliorée en augmentant la lumière incidente. Cependant, les fluorophores peuvent se décomposer sous une irradiation intense (photoblanchiment), la stabilité sous irradiation constitue donc un critère important dans le choix du fluorophore.
Toutefois, l’efficacité de la fluorescence et la longueur d’onde d’émission sont affectées par l’environnement de la molécule, notamment le solvant, les composants de la solution ou les autres fragments moléculaires auxquels le groupe fluorophore est attaché. Le bruit de fond élevé peut réduire la sensibilité effective et rendre plus difficile la détection de différences subtiles entre les échantillons. En réalité, la limite de détection est déterminée par le rayonnement de fond émis par les composants de l’échantillon autres que l’analyte. Certaines stratégies peuvent être mises en œuvre pour contourner cet inconvénient. Par exemple, la fluorescence de fond des échantillons organiques est généralement limitée à la région visible ; la fluorescence peut donc être avantageusement mesurée dans l’infrarouge.
En bioluminescence, l’intensité de la lumière émise n’est pas aussi forte qu’en fluorescence. Néanmoins, le rapport signal/bruit est généralement plus élevé. Cela s’explique par le fait que le bruit de fond est intrinsèquement minimal, puisque la majorité des systèmes biologiques ne présentent pas de propriétés bioluminescentes. Ainsi, la bioluminescence devient la meilleure option pour les applications nécessitant une grande sensibilité, telles que le suivi de l’expression génique endogène au cours du temps ou la surveillance des voies de signalisation dans des cellules vivantes.
Applications
Les différences entre fluorescence et bioluminescence influencent leurs applications analytiques. Le choix entre les deux techniques dépend de leurs différences en termes de résolution spatio-temporelle et de sensibilité.
Ainsi, la fluorescence est l’option idéale pour les expériences d’imagerie, car elle offre une résolution spatiale et temporelle élevée, permettant un suivi précis des protéines marquées dans des cellules vivantes et la visualisation de l’architecture tissulaire. De plus, la fluorescence permet le multiplexage grâce à l’utilisation de plusieurs fluorophores et filtres, permettant le suivi simultané de différentes cibles dans le même échantillon. Par conséquent, la fluorescence est optimale pour la cytométrie en flux, la microscopie et l’imagerie en temps réel des événements cellulaires.
À l’inverse, la bioluminescence est plus adaptée aux applications nécessitant une grande sensibilité et une interférence minimale du bruit de fond. Comme le signal analytique est généré en interne et ne nécessite pas de source externe, la bioluminescence présente de meilleures performances pour les essais cinétiques et sur cellules vivantes lorsque la cible est faiblement abondante. Les principales applications de la bioluminescence incluent donc le suivi de l’expression génique, l’évaluation des interactions protéine-protéine et le suivi d’événements dynamiques de signalisation au fil du temps. De plus, les essais basés sur la bioluminescence étant moins phototoxiques que les essais fluorescents, ils sont plus doux pour les cellules vivantes lors d’expériences de longue durée.
Dans le cas particulier de l’imagerie de cellules vivantes, celle-ci peut être réalisée avec la fluorescence ou la bioluminescence à l’aide de rapporteurs appropriés. D’une part, les essais fluorescents peuvent être réalisés avec plusieurs rapporteurs permettant une résolution temporelle et spatiale, afin de visualiser les changements au cours du temps ou dans différents compartiments cellulaires. D’autre part, la bioluminescence offre une stabilité accrue du signal analytique, permettant d’observer la dynamique des protéines dans des cellules vivantes sans nécessité d’excitation répétée de l’échantillon. Cela réduit la phototoxicité et le photoblanchiment, qui peuvent affecter négativement la viabilité cellulaire et l’intégrité du signal au fil du temps.
Imagerie par fluorescence et marquage multiplex
Ces dernières années, le développement de nouvelles molécules fluorescentes et de nouvelles sondes a transformé le domaine de l’imagerie moléculaire, et divers biomolécules et événements physiologiques dans des cellules vivantes sont désormais plus faciles à suivre. Plusieurs innovations ont été rapportées, notamment le développement de séries de fluorophores permettant une imagerie multicolore simultanée, l’amélioration de la luminosité de la fluorescence, les progrès des technologies de marquage des fluorophores, le développement de différents types de conception de sondes, ainsi que les avancées en photostabilité et en rapport signal/bruit. Comparée à l’imagerie par bioluminescence, l’imagerie par fluorescence présente une luminosité plus élevée, favorisant la visualisation des cibles avec une résolution optique et sur une échelle de temps de l’ordre de la milliseconde, sans nécessiter de substrats ni de cofacteurs. Grâce aux innovations développées, la bioimagerie par fluorescence est actuellement la technique la plus utilisée pour étudier les dynamiques spatio-temporelles des molécules cibles et des événements dans des entités vivantes [1].
En outre, la fluorescence offre la possibilité d’effectuer des analyses multiplexées. Cela fait référence à l’utilisation de plusieurs fluorophores pour visualiser différentes cibles au sein d’un même échantillon. Le multiplexage permet l’observation simultanée de composants et de processus liés, enrichissant l’observation avec le contexte environnant, fournissant ainsi davantage d’informations et des résultats plus significatifs. La détection fluorescente multiplexée en temps réel peut révéler la stœchiométrie, les dynamiques et les interactions de multiples molécules dans des échantillons complexes, sous forme d’image multicolore [4].
Néanmoins, le choix de la bonne combinaison de fluorophores pour votre expérience est déterminant pour obtenir des résultats optimaux. La plupart des fluorophores possèdent un large spectre d’émission ; ainsi, lorsque deux fluorophores ou plus sont utilisés, leurs spectres peuvent se chevaucher, provoquant des interférences de signal. Si cela n’est pas pris en compte, les données peuvent être affectées par des faux négatifs ou des faux positifs. Afin d’éviter ou de minimiser les problèmes d’interférences, les spectres d’excitation et d’émission des fluorophores doivent correspondre aux caractéristiques de la source lumineuse et du jeu de filtres du système, et les spectres d’émission de chaque fluorophore doivent présenter un chevauchement minimal.
Essais bioluminescents, essais luciférase et criblage
Les essais de bioluminescence reposent sur l’utilisation d’enzymes luciférases, qui peuvent être regroupées selon leur famille ou leur substrat luciférine, et comprennent des rapporteurs à D-luciférine et des rapporteurs à coelentérazine. La luciférase de luciole (FLuc) est probablement le rapporteur à luciférine le plus utilisé dans le domaine du criblage à haut débit (HTS). FLuc est une enzyme hydrolysant l’ATP qui utilise l’ATP, un cation métallique et des substrats luciférine pour produire de l’oxyluciférine dans un état excité, ainsi qu’une émission de photons (~560 nm) lorsque l’oxyluciférine excitée retourne à l’état fondamental. FLuc présente une activité luminescente élevée sur une large plage linéaire d’environ sept ordres de grandeur [5].
Divers essais bioluminescents ont été développés pour différentes applications, notamment les essais de prolifération et de viabilité cellulaire, les essais d’activité enzymatique et les essais de gènes rapporteurs, entre autres. L’application la plus courante de la bioluminescence en HTS est probablement la détermination de la viabilité et de la prolifération cellulaires, basée sur la nécessité d’ATP dans l’oxydation de la D-luciférine médiée par FLuc et sur le fait que seules les cellules viables produisent de l’ATP (Figure 4a). Dans les essais d’activité enzymatique, les essais de détection de l’ATP mesurent l’activité des enzymes consommant de l’ATP, et le signal luminescent est corrélé au niveau d’ATP, ou inversement proportionnel à l’activité enzymatique (Figure 4b). Dans les essais de gènes rapporteurs, en clonant la région régulatrice d’un gène d’intérêt en amont d’un gène luciférase ou d’un vecteur d’expression, le signal luminescent peut être utilisé pour mesurer l’activité de l’élément régulateur ou des protéines dans la voie biologique affectée par l’élément cible (Figure 4c). Les essais rapporteurs sont fréquemment utilisés dans les approches HTS, où des lectures rapides et économiques sont nécessaires pour classer les cibles dans les procédures de criblage.
Figure 4 – Représentation schématique de plusieurs essais basés sur la luminescence. Reproduit à partir de [2].
Quand choisir la bioluminescence ?
Si la sensibilité et le rapport signal/bruit sont les aspects cruciaux de votre expérience (par exemple, lors de la détection de signaux faibles dans des cellules vivantes ou de la mesure de réponses dynamiques au cours du temps), la bioluminescence est le meilleur choix. L’absence d’autofluorescence et de photoblanchiment la rend particulièrement efficace pour les cibles faiblement abondantes et les études cinétiques à long terme. En outre, les essais basés sur la bioluminescence répondent au besoin actuel de réaliser des tests rapides, à haut débit et rentables, et permettent de mener des essais enzymatiques avec précision et haute sensibilité.
Les progrès récents concernant l’intensité lumineuse, la structure et la fonction des enzymes luciférases et de leurs substrats ont élargi les applications de la bioluminescence dans l’évaluation de l’activité, des dynamiques et des interactions des cibles. De plus, les avancées en microscopie bioluminescente ont permis de surmonter certains défis, tels que les longs temps d’acquisition des images, conduisant à l’imagerie réussie de structures cellulaires à l’échelle de la cellule unique. Les nouvelles sondes bioluminescentes développées offrent une sensibilité améliorée par rapport aux sondes fluorescentes traditionnelles et sont susceptibles d’élargir le champ d’application de ces outils.
Exploiter le potentiel du criblage à haut débit acellulaire
La production de protéines acellulaires révolutionne le criblage à haut débit, permettant une recherche plus rapide, plus efficace et plus polyvalente dans de nombreux domaines. Que vous exploriez la découverte de médicaments, l’ingénierie enzymatique ou l’analyse des protéines membranaires, l’adoption d’une approche de criblage à haut débit acellulaire peut accélérer considérablement vos découvertes.
Résumé
La fluorescence et la bioluminescence sont deux formes de luminescence, c’est-à-dire l’émission de rayonnement par une molécule, impliquant deux étapes : l’excitation, au cours de laquelle un état excité est produit, suivie d’une relaxation vers l’état fondamental avec émission de lumière. En fluorescence, l’excitation d’une molécule (fluorophore) résulte d’une irradiation lumineuse, tandis qu’en bioluminescence les molécules excitées sont produites par des réactions biochimiques particulières.
Écrit par Luísa Silva, PhD et rédactrice scientifique.
Sources
