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Les particules pseudovirales (VLP) sont des nanostructures constituées de protéines virales assemblées, dépourvues de matériel génétique viral et donc non infectieuses. Leur intérêt réside dans la possibilité de les utiliser pour transporter et délivrer des médicaments, des vaccins ou des substances d’imagerie.
Elles peuvent être produites dans divers systèmes in vivo, y compris des bactéries, des insectes, des plantes et des mammifères, ainsi que dans des systèmes acellulaires. En fait, les systèmes acellulaires ont déjà prouvé qu’ils pouvaient synthétiser des VLP fonctionnelles, en présentant plusieurs avantages par rapport aux systèmes in vivo.
Tout d’abord, les systèmes acellulaires permettent de traduire simultanément plusieurs ARNm, ce qui facilite la production de complexes actifs comprenant un certain nombre de sous-unités différentes.
Deuxièmement, la technologie acellulaire est particulièrement avantageuse lorsque les conditions optimales d’assemblage sont difficiles à établir in vivo, notamment lorsque la force ionique, le pH et/ou le potentiel d’oxydoréduction ne sont pas physiologiques [1].
Troisièmement, la production et la stabilité des VLP dépendent de la formation de ponts disulfures, qui peut être réalisée et contrôlée dans des systèmes acellulaires en ajustant le potentiel redox de la réaction [2,3].
Enfin, les systèmes acellulaires permettent d’obtenir des rendements plus élevés lorsque les protéines virales sont cytotoxiques ou insolubles in vivo [4].
On trouve dans la littérature plusieurs exemples illustrant la production avantageuse de VLP par des systèmes acellulaires. La VLP de la protéine d’enveloppe du bactériophage MS2 (VLP MS2) et une VLP de la protéine centrale de l’hépatite B tronquée en C-terminal (VLP HBV) ont été produites dans un système acellulaire basé sur Escherichia coli, rapportant pour la première fois l’utilisation d’un système acellulaire basé sur des procaryotes pour produire des VLP assemblées de manière efficace [5]. Les rendements de production et d’assemblage étaient plus élevés que les meilleurs rendements publiés précédemment (l’efficacité d’assemblage pour la VLP MS2 et la VLP HBV produites à partir de réactions CFPS de 30 µl et 1 ml était ≥ 80 %, ce qui a donné des rendements de VLP assemblées compris entre 356 et 442 µg/ml). En outre, le système acellulaire proposé a montré un potentiel de mise à l’échelle.
Un moyen d’accélérer et d’optimiser la production de VLP…
Dans un autre travail, deux protéines de capside de VLP de norovirus humain (HuNoV) (VP1 du HuNoV de génotype GII.3 (VP1-GII.3) et de génotype GII.4 (VP1-GII.4)) ont été synthétisées à l’aide d’un système acellulaire basé sur E. coli [6]. Les deux protéines présentaient la bonne masse moléculaire et se sont assemblées en VLP de taille et de morphologie précises. Les rendements obtenus étaient comparables à ceux obtenus à l’aide d’un système cellulaire Pichia pastoris, mais avec l’avantage d’un temps de production de 4 heures, par rapport au temps de production de >50 heures des systèmes cellulaires, en plus d’être plus rentables.
Les systèmes de synthèse de protéines acellulaires (CFPS) peuvent également permettre la fonctionnalisation de la surface des VLP, en utilisant la chimie click catalysée par le Cu(I), permettant la conjugaison directe de protéines contenant des azides et des alcynes (y compris un fragment d’anticorps et le facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages), des acides nucléiques et des chaînes de polyéthylène glycol à la surface de la VLP [7]. La procédure d’attachement direct rapportée a permis de conjuguer trois ligands différents aux VLP en une seule étape et a permis de contrôler les rapports relatifs et l’abondance de surface des espèces attachées.
À partir de différents systèmes acellulaires
Un système d’expression acellulaire eucaryote a été utilisé pour produire le virus de l’encéphalomyocardite à partir d’un ADN plasmidique ou d’un produit PCR [8]. Le système utilisait un extrait de cellules HeLa, complété par l’ARN polymérase T7, et le virus a été produit en 4 heures avec une grande efficacité. En outre, le système ne nécessitait ni la synthèse ni la purification de l’ARN pour produire les particules virales in vitro, ce qui est un avantage pour la production de particules virales. Un système d’expression acellulaire a également été développé pour la production de poliovirus [9].
Des systèmes acellulaires à base de lysat de réticulocytes de lapin ont permis l’expression et l’assemblage de la polyprotéine GAG du VIH [10] et de la capside du virus de l’hépatite C [11]. Un système acellulaire à base d’extrait cellulaire de levure s’est également révélé efficace pour l’expression de la protéine L1 du papillomavirus humain 58 (HPV58) et l’assemblage de VLP à partir de la protéine de capside mentionnée [12].
En conclusion, la technologie CFPS se révèle être une alternative précieuse et même avantageuse aux systèmes cellulaires pour la production de VLP. La production acellulaire de VLP peut être réalisée à partir d’extraits de diverses sources cellulaires et une large gamme de structures VLP peut être synthétisée efficacement, ce qui démontre la grande polyvalence de la CFPS.
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Sources
[1] Ceres P., Zlotnick A. 2002. Weak protein-protein interactions are sufficient to drive assembly of hepatitis B virus capsids. Biochemistry 41:11525-11531.
https://doi.org/10.1021/bi0261645
[2] Bundy B.C., Swartz J.R. 2011. Efficient disulfide bond formation in virus-like particles. J. Biotechnol. 154:230-239.
https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2011.04.011
[3] Kim D., Swartz J.R. 2004. Efficient production of a bioactive, multiple disulfide-bonded protein using modified extracts of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 85:122-129.
https://doi.org/10.1002/bit.10865
[4] Stiege W., Erdmann V.A. 1995. The potentials of the in vitro protein biosynthesis system. J. Biotechnol. 41:81-90.
https://doi.org/10.1016/0168-1656(95)00005-B
[5] Bundy B.C., Franciszkowicz M.J., Swartz J.R. 2008. Escherichia coli-based cell-free synthesis of virus-like particles. Biotechnol. Bioeng. 100:28-37.
https://doi.org/10.1002/bit.21716
[6] Sheng J., Lei S., Yuan L., Feng X. 2017. Cell-free protein synthesis of norovirus virus-like particles. RSC Adv. 7:28837.
https://doi.org/10.1039/c7ra03742b
[7] Patel K.G., Swartz J.R. 2011. Surface functionalization of virus-like particles by direct conjugation using azide−alkyne click chemistry. Bioconjug. Chem. 22:376-387.
https://doi.org/10.1021/bc100367u
[8] Kobayashi T., Nakamura Y., Mikami S., Masutani M., Machida K., Imataka H. 2012. Synthesis of encephalomyocarditis virus in a cell-free system: from DNA to RNA virus in one tube. Biotechnol. Lett. 34:67-73.
https://doi.org/10.1007/s10529-011-0744-z
[9] Franco D., Pathak H.B., Cameron C.E., Rombaut B., Wimmer E., Paul A.V. 2005. Stimulation of poliovirus synthesis in a HeLa cell-free in vitro translation-RNA replication system by viral protein 3CDpro. J. Virol. 79:6358-6367.
https://doi.org/10.1128/JVI.79.10.6358-6367.2005
[10] Spearman P., Ratner L. 1996. Human immunodeficiency virus type 1 capsid formation in reticulocyte lysates. J. Virol. 70:8187-8194.
[11] Klein K.C., Polyak S.J., Lingappa J.R. 2004. Unique features of hepatitis C virus capsid formation revealed by de novo cell-free assembly. J. Virol. 78:9257-9269.
https://doi.org/10.1128/JVI.78.17.9257-9269.2004
[12] Wang X., Liu J., Zheng Y., Li J., Wang H., Zhou Y., Qi M., Yu H., Tang W., Zhao W.M. 2008. An optimized yeast cell-free system: sufficient for translation of human papillomavirus 58 L1 mRNA and assembly of virus-like particles. J. Biosci. Bioeng. 106:8-15. https://doi.org/10.1263/jbb.106.8