Expression
de protéines
en système
E. coli.

Un système classique,
maîtrisé par des experts

Étape 1/

Etude de faisabilité

Étape 2/

Production d'échantillon

Étape 3/

Caractérisation fonctionnelle et structurale des protéines

Étape 4/

Production

Outre les technologies acellulaires, l’équipe Synthelis possède également une grande expertise dans la production de protéines en système E. coli. Selon le type de protéine, nous vous proposerons de travailler en expression cytoplasmique ou en expression périplasmique. Nos services vont de l’étude de faisabilité jusqu’à la production en fermenteur de 10 L.

Étape 1/

Étude de faisabilité

Discussion de votre projet et de vos attentes

Dès que vous nous aurez fait part de votre demande, nous vous proposerons un premier échange téléphonique ou par visioconférence, afin de discuter de votre projet pour bien comprendre vos besoins et vos objectifs. Un accord de confidentialité pourra être mis en place si besoin à ce stade.

Nous contacter$

Étude préliminaire et établissement d’un devis

Etude bibliographique et analyse de séquence
À partir des informations que vous nous aurez fournies, nous allons rechercher dans la littérature et/ou analyser les articles que vous nous aurez transmis, afin d'identifier les conditions préalables et le système fonctionnant le mieux pour exprimer votre protéine d'intérêt. Nous allons ainsi rassembler toutes les conditions ayant un impact positif sur l'expression de la protéine mais aussi détecter toute difficulté potentielle que nous pourrions rencontrer.
En utilisant les bases de données sur les protéines et nos outils d'analyse des séquences, nous établirons, sur la base de cette étude préliminaire, un plan de travail et un devis afin d'évaluer rapidement et efficacement notre capacité à produire votre protéine d'intérêt.

En option : ingénierie protéique in silico
Grâce à notre partenariat avec des sociétés d'intelligence artificielle qui ont développé des solutions propriétaires pour prédire les caractéristiques des protéines in-silico, nous pouvons générer très rapidement et efficacement une bibliothèque de mutants qui auront la propriété spécifique ou optimisée que vous recherchez pour votre produit ou réactif : stabilité accrue, activité améliorée, affinité plus forte, meilleure spécificité...

Conception et réalisation du vecteur d’expression

La conception de la construction ADN est également une étape critique où l’expérience d’un spécialiste fait la différence et augmente les chances de succès d’un projet de production de protéines.
Ainsi, le bon choix de l’étiquette (tag) d’expression (6xHis, Avi, Strep…), son positionnement par rapport au gène, la taille de la séquence entre l’étiquette et la région codante, la sélection du promoteur… sont autant de facteurs influençant le niveau d’expression, la purification et le bon repliement de la protéine.

Forts de notre expertise de plus de 15 années en production de protéines et de nos partenaires spécialistes en biologie moléculaire, nous saurons vous recommander la ou les construction(s) ADN qui permettra (-ont) d’exprimer et purifier votre protéine d’intérêt de manière optimale.

Criblage des conditions d’expression

Dès que nous aurons une construction ADN prête à l’emploi, nous testerons les différents paramètres clés pour chaque système d’expression utilisé :
– concentration en sels, type d’extrait cellulaire, T°C… pour le système de synthèse protéique sans cellules (CFPS)
– T°C, milieu, clones… pour les systèmes basés sur E. coli
La combinaison de paramètres donnant le meilleur niveau d’expression et une protéine entière, soluble le cas échéant, sera à cette étape, sélectionnée par analyse Western Blot.
– Estimation du rendement de l’expression

Lorsque les meilleures conditions d’expression sont définies, une production à petite échelle est réalisée pour permettre le développement du protocole de purification et estimer le rendement de production de la protéine.

La formulation finale
Le choix du tampon final est un point qui peut s'avérer critique, notre expérience pourra vous aider dans ce choix, afin de vous offrir la meilleure solution selon votre application.

Nous pouvons vous proposer les principales techniques de chromatographie et notre savoir-faire pour définir les bonnes conditions afin de purifier votre protéine d’intérêt. Ainsi, selon le niveau de pureté attendu, nous pouvons mettre en œuvre :

Différentes chromatographies d'affinité (IMAC, protéine A…)

Elles utilisent soit l’affinité propre de la protéine (anticorps, protéase par exemple), soit celle de l'étiquette qui lui est associée, pour purifier la protéine de façon très sélective même dans un mélange complexe. Ces techniques permettent d'obtenir rapidement une protéine avec un bon niveau de pureté.

La Chromatographie par Échange d'Ions (IEC)

C'est une méthode prédictive utilisant le point isoéléctrique (pI) de la protéine pour réaliser sa purification. Bien qu'ayant une sélectivité limitée, elle est très robuste et peut être efficacement utilisée en première intention, notamment avec des protéines sans étiquette (tag).

La Chromatographie par Interaction Hydrophobe (HIC)

Elle utilise les domaines hydrophobes de la protéine afin de la retenir sur une résine. Cette technique, certes peu prédictive, peut servir en complément d’une autre méthode.

La chromatographie par exclusion de taille (SEC)

Elle est basée sur le diamètre apparent de la protéine (dépendant de sa masse moléculaire et de son état oligomérique). Cette technique est très efficace pour améliorer la pureté d'une protéine et modifier le tampon final.

Nous sommes aussi en mesure de vous proposer des méthodes complémentaires selon les propriétés physicochimiques des protéines.

Dans le cas des protéines membranaires au format protéoliposomes, la purification est réalisée par sédimentation sur gradient de saccharose. Ceci permet de purifier la fraction de liposomes ayant intégré la protéine membranaire d’intérêt, mais ne permet pas d’éliminer toutes les impuretés protéiques issues du lysat bactérien de notre système acellulaire.

Afin d’éliminer les interférences éventuelles de ces impuretés dans votre application, nous vous proposons des protéoliposomes « contrôle négatif » contenant les mêmes impuretés mais sans votre protéine d’intérêt.

Étape 2/

Production d’échantillon

Lorsque les meilleures conditions d’expression sont définies, une production à petite échelle est réalisée pour permettre le développement du protocole de purification et estimer le rendement de production de la protéine. Le produit purifié obtenu est ensuite soit expédié au client pour être testé, soit utilisé dans le cadre des tests de contrôle de la qualité effectués à Synthelis.

Étape 3/

Caractérisation fonctionnelle et structurale des protéines

Pour garantir la qualité des protéines que nous avons synthétisées pour vous ou que vous avez produites, nous vous proposons nos services d’analyses qualitatives. Ces analyses nous permettent notamment de déterminer le niveau de pureté de la protéine d’intérêt, de valider son identité et d’étudier l’homogénéité de la solution obtenue.

Certaines analyses telles que le contrôle par SDS-Page et l’analyse par Western-blot sont incluses dans nos offres de production de protéines afin de s’assurer de la pureté et de l’identité du produit obtenu.

Nous pouvons en fonction de vos besoins compléter cette offre par différentes méthodes permettant une étude plus approfondie. Ainsi nous vous proposons, entre autres, de vérifier l’identité et l’intégrité de la protéine par spectrométrie de masse, d’analyser l’état d’oligomérisation par SEC, SEC-MALS ou DLS et d’étudier la stabilité de la protéine par TSA. Nous pouvons également contrôler la présence d’endotoxines et vérifier la stérilité du produit.

Méthodes - Information sur la protéine/l'échantillon

SDS-PAGE (conditions réductrice et non-réductrice) - Pureté

Western blotting - Identité et intégrité

Spectrométrie de masse - Poids moléculaire exact et séquence

Size Exclusion Chromatographie (SEC) - Etat oligomérique et pureté

Thermal Shift Assay (TSA) - Stabilité de la protéine

LAL - Dosage des endotoxines

Étude de stérilité - Contamination

RP- & SE-HPLC - Identité et pureté

nanoDSF - Stabilité et repliement

Afin de caractériser au mieux les protéines produites dans nos systèmes, acellulaire ou cellulaire, nous proposons différentes méthodes de quantification pour répondre à vos besoins spécifiques.
Ainsi nous incluons de façon standard un dosage UV afin de déterminer la concentration de la protéine obtenue en solution, ou pour les protéines produites en protéoliposomes, une quantification sur gel SDS-PAGE.

Nous pouvons également en fonction de vos projets, réaliser d’autres quantifications telles que des essais colorimétriques de type Bradford ou Pierce et des dosages d’acides aminés.

Méthodes - Information sur la protéine/l'échantillon

SDS-PAGE - Quantité spécifique

Dosage UV - Quantité totale de protéines

Dosage colorimétrique - Quantité totale de protéines

Dosage d’acides aminés - Quantité totale

Les interactions entre protéines sont à la base de la majorité des processus cellulaires et sont indispensables à un grand nombre de fonctions dans le monde du vivant. Ces interactions sont notamment impliquées dans la transduction de signaux, la formation de complexes protéiques, le transport de protéines, l’activation ou l’inhibition de voies métaboliques…
Nous vous proposons d’étudier les interactions de votre protéine d’intérêt avec son ligand. Il existe de nombreuses méthodes d’investigation des interactions protéine-protéine. Chaque méthode ayant ses avantages et inconvénients. Nous vous proposons une grande variété de techniques : SPR, BLI, ITC, FRET ou MST notamment afin de pouvoir choisir la plus adaptée à votre projet.

Nous avons accès pour ces analyses, aux instruments suivants :
Monolith NT.115 (MST)
Octet® RED96e (BLI)
Biacore T200 (SPR)
PEAQ-ITC (très sensible et nécessite de petits volumes d’échantillons)

Méthodes - Information sur la protéine/l'échantillon

ELISA

Microscale thermophoresis (MST) - Spécificité et affinité

BLI - Spécificité et affinité

SPR - Spécificité, Kd, Kon, Koff

PEAQ-ITC - Stoechiométrie de liaison (n), constante d’affinité (KD), et variations d’enthalpie (ΔH) et d’entropie (ΔS)

Nous pouvons vérifier l’activité de vos protéines grâce à des tests d’activité enzymatique, des tests électrophysiologiques sur Orbit Mini (Nanion) et nous pouvons également en fonction de vos besoins développer et réaliser des tests d’activités à façon.

Méthodes - Information sur la protéine/l'échantillon

Patch-clamp - Activité de canal

Activité enzymatique - Fonctionnalité

Tests à façon - Fonctionnalité

Liaison de radio-ligand(s) - Activité spécifique

Enfin, nous pouvons vous proposer plusieurs analyses structurales, allant de l’évaluation des structures secondaires par Dichroïsme Circulaire (CD) ou Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier (FTIR), à la résolution de structure tridimensionnelle par cryo-microscopie électronique (Cryo-EM), spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (NMR) ou par cristallographie et diffraction aux rayons X.

Nous avons accès pour ces analyses, aux instruments suivants :

Microscopes électroniques à transmission :
FEI Tecnai F20 200kV FEG
Thermo Scientific GLACIOS 200kV FEG

Spectromètres :
950 MHz Bruker Avance III HD Liquide / Solide
850 MHz Bruker Avance III HD Liquide
600 MH Bruker Avance III HD Liquide / Solide

Cristallographie et diffraction aux rayons X :
Robot de cristallisation « TTP-Labtech nanovolume crystallisation » et robot de visualisation
Accès au synchrotron de l’ESRF

Méthodes - Information sur la protéine/l'échantillon

Dichroïsme Circulaire - % structures secondaires

Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier (FT-IR) - % structures secondaires

Microscopie à Force Atomique (AFM) - Orientation de la protéine et validation des domaines transmembranaires

Cryo-EM - Structure tridimensionnelle

Diffraction aux rayons X - Structure tridimensionnelle

RMN

Étape 4/

Production

De la conception à la purification, nous optimisons chaque étape pour maximiser l’expression et la qualité de votre protéine.
En fonction des besoins, nous pouvons produire des protéines à petite échelle pour du criblage ou des tests préliminaires (volumes de 4 à 250 mL). Une fois les conditions optimisées, la production peut être montée en échelle jusqu’à plusieurs litres (1 L à 8 L, voire plus) pour obtenir des quantités suffisantes, allant du milligramme au gramme de protéine purifiée.

Développement de procédés et industrialisation

Notre équipe est là pour vous accompagner si vous souhaitez améliorer votre procédé de production ou changer d’échelle. Nous disposons d’un fermenteur de 10 L, d’équipements de purification et surtout d’une expertise qui vous permettront de poser les premiers jalons dans le développement et la réussite de votre projet. N’hésitez pas à nous contacter pour en savoir plus.